Influência da técnica de plaqueamento sobre as contagens de lactobacillus bulgaricus em iogurtes

1 INTRODUÇÃO

O iogurte natural padrão é um leite fermentado elaborado exclusivamente com ingredientes lácteos e obtido por ação simbiótica das bactérias láticas Streptococcus salivarius subsp. thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus (1). Essas bactérias láticas, quando consumidas juntas em iogurtes, em quantidades adequadas (≥10⁸ UFC/g) podem exercer efeito benéfico a saúde humana (2) e para assegurar esse benefício, muitos estudos de monitoramento da viabilidade de bactérias láticas em iogurtes têm sido conduzidos em todo o mundo.

A maioria desses estudos utilizaram contagens seletivas em ágar M17 e ágar MRS para S. thermophilus e L. bulgaricus, respectivamente, de acordo com a metodologiaISO 7889:2003 (3). Entretanto, modificações nesse método são observadas, especialmente na contagem de L. bulgaricus, incluindo mudanças nas técnicas de plaqueamento (4,5,6).

Considerando que os resultados dessas contagens são utilizados para atestar que iogurtes comerciais apresentam as quantidades mínimas exigidas de bactérias láticas, é de suma importância que os métodos selecionados para fazer essas investigações sejam confiáveis.

Diante do exposto, o objetivo dessa pesquisa foi verificar a influência da técnica de plaqueamento nas contagens de L. bulgaricus em iogurtes.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Coleta das amostras

Amostras de duas marcas de iogurtes naturais comerciais (produtos A e B) foram coletadas em supermercados da cidade de João Pessoa-PB, nos períodos de fevereiro à maio de 2021, sendo obtidas 05 unidades de amostras, por marca, todas de diferentes lotes. Essas marcas foram selecionadas, com base em estudos preliminares, por apresentarem números elevados de lactobacilos nas amostras analisadas (7). O transporte foi realizado em caixa isotérmica contendo gelo e no laboratório as amostras foram mantidas sob refrigeração até o momento das análises de pH, acidez e contagem de Lactobacillus bulgaricus.

2.2 Viabilidade de Lactobacillus bulgaricus utilizando diferentes técnicas de plaqueamento

           Amostras foram submetidas as diluições decimais seriadas, utilizando água peptonada 0,1% esterilizada (Merck, São Paulo, Brasil) e subsequentemente plaqueadas em ágar MRS (De Man, Rogosa e Sharpe) (HiMedia, Mumbai, India), utilizando-se as técnicas spread plate, pour plate e pour plate com cobertura. Todas as placas foram incubadas em aerobiose a 37ºC, por 48-72 horas e após incubação, foram selecionadas as que apresentavam 25-250 colônias, para a contagem, sendo os resultados expressos em log ufc/g. Além das contagens, foi avaliada a morfologia das colônias obtidas sendo selecionados todos os tipos diferentes de colônias ou pelo menos 5 colônias idênticas por placa, para serem submetidas a coloração de Gram e teste de catalase.

2.3 Determinação de pH e acidez das amostras

 O pH foi determinado em 50 g de amostra, homogeneizada em um béquer de 100 mL, utilizando um potenciômetro digital (QUIMIS^®, Q400AS, São Paulo, Brasil) previamente calibrado. Para a acidez, 10 g de amostra, homogeneizada em 10 mL de água destilada, foi titulada com solução de hidróxido de sódio N/9, em presença do indicador fenolftaleína (Dinâmica Química Contemporânea®, Indaiatuba, Brasil). Os resultados da acidez foram expressos em % de ácido lático/100 g produto (8).

2.4 Análise dos resultados

Os resultados das análises de pH, acidez e contagens de L. bulgaricus foram submetidos as determinações de média e desvio-padrão, enquanto os dados das contagens foram também submetidos a Análise de Variância (ANOVA) e ao pós-teste de Tukey, ao nível de significância de 5%. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Graphpad Prism 8.0 .1.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Viabilidade de Lactobacillus bulgaricus em iogurtes naturais utilizando diferentes técnicas de plaqueamento

          Nas Tabelas 1 e 2 estão apresentadas as médias das contagens de Lactobacillus bulgaricus (log UFC/g) em iogurtes naturais comerciais das marcas A e B, respectivamente, utilizando diferentes técnicas de plaqueamento.

De acordo com a Tabela 1, houve redução significativa nas contagens de L. bulgaricus no iogurte da marca A, em quase 1 ciclo logarítmico (spread plate: 7,67 log ufc/g; pour plate: 8,55 log ufc/g: pour plate com cobertura: 8,47 log ufc/g), quando a técnica spread plate foi utilizada.

Quando esses resultados foram comparados com os obtidos para o iogurte da marca B houve divergência, pois nenhuma técnica de plaqueamento diferiu de forma significativa (spread plate: 6,25 log ufc/g; pour plate: 7,00 log ufc/g; pour plate com cobertura: 7,00 log ufc/g). Esse resultado sugere que a influência da técnica spread plate na redução das contagens de L. bulgaricus em iogurtes é dependente da linhagem presente no produto, o que explicaria a diferença observada no comportamento das duas marcas testadas. Possivelmente, as linhagens presentes no iogurte da marca A eram mais sensíveis ao oxigênio que as da marca B e por essa razão houve redução nas contagens devida a maior exposição a esse gás na técnica spread plate.

Diante do exposto, parece ser mais adequado o uso de técnicas que reduzam a exposição ao oxigênio, como ocorre nas técnicas pour plate e pour plate com cobertura. Essas, possibilitaram o bom crescimento de L. bulgaricus em ambas as marcas. Apesar do desempenho satisfatório, a técnica pour plate com cobertura utiliza mais meio de cultura, elevando os custos da análise, sem resultar em aumento significativo das contagens de lactobacilos. Por essa razão, a técnica pour plate parece ser a melhor opção. Esta já é comumente adotada em estudos sobre viabilidade de lactobacilos em leites fermentados (9,10) e é recomendada pelo método ISO 7889:2003 (3).

A boa seletividade do ágar MRS para lactobacilos em iogurtes foi observada em ambas as amostras, tendo ocorrido um único tipo de colônia (circular, branca, borda regular, plana), com diâmetro em torno de 1,0 mm, nas placas preparadas pela técnica spread plate (Figura 1), e colônias circulares, com diâmetro variando de 1-2 mm nas demais técnicas utilizadas (Figura 2 e 3), sendo todas identificadas por microscopia como bacilos Gram-positivos e catalase- negativos.

3.2 pH e acidez

         Os resultados das análises de pH e acidez (% de ácido lático) dos iogurtes naturais comerciais das duas marcas (A e B) estão descritos na Tabela 3.

Os resultados de pH oscilaram entre 3,84 e 4,21 na marca A e de 3,76 a 4,45 na marca B, demonstrando pela média, que a marca A é um pouco mais ácida do que a marca B. Na legislação brasileira não há limites para pH de iogurtes, porém em outros países, como Austrália, o limite máximo é de 4,5 (11). Com relação ao limite mínimo, alguns pesquisadores demostraram que pH abaixo de 3,5 acarreta em alguns problemas como a baixa viabilidade de bactérias láticas devido a acidificação excessiva (12,13,14). Nessa pesquisa, não foram encontradas amostras com pH acima de 4,5 nem abaixo de 3,5.

Os valores de acidez variaram de 1,07 a 1,35 para amostras da marca A e de 1,03 a 1,21 para amostras da marca B. Sendo assim, todas elas atenderam a exigência da legislação brasileira que determina como limites mínimo e máximo para a acidez do iogurte os valores de 0,6% e 1,5% de ácido lático, respectivamente (1).

Em outros estudos sobre pH e acidez de iogurtes comerciais produzidos no Brasil foram verificados também valores satisfatórios para pH e acidez (15,16,17).

4 CONCLUSÃO

           O uso da técnica spread plate pode promover reduções significativas nas contagens de L. bulgaricus em iogurtes, porém, esse efeito se mostrou dependente da marca avaliada.  Nas demais técnicas, o desempenho foi igual ou superior ao da técnica spread plate, porém, a técnica pour plate pareceu ser a mais adequada, quando foi considerado o binômio custo/benefício, por promover crescimento similar a técnica pour plate com cobertura, utilizando menor quantidade de meio de cultura.

5 REFERÊNCIAS

1. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Portaria n.46 de 23 de novembro de 2007: Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados, 2007.
2. URIOT, O.; DENIS, S.; JUNJUA, M.; ROUSSEL, Y.; DARY-MOUROT, A.; BLANQUET-DIOT, S. Streptococcus thermophilus: From yogurt starter to a new promising probiotic candidate?. Journal of Functional Foods, v. 37, p. 74-89, 2017.
3. ISO- International Standard Organization (2003) Yogurt – Enumeration of Characteristic Microorganisms – Colony-count Technique at 37 Degrees C (ISO 7889:2003). Geneva, Switzerland: International Organization of Standardization (IDF 117:2003).
4. BABA, A. S., NAJARIAN, A., SHORI, A. B., LIT, K. W., & KENG, G. A. Viability of lactic acid bacteria, antioxidant activity and in vitro inhibition of angiotensin-I-converting enzyme of Lycium barbarum yogurt. Arabian Journal for Science and Engineering, v. 39, n. 7, p. 5355-5362, 2014.
5. FERNANDES, A. F. C., COSTE E COLPA, P., PAIVA, E. F. F., PAIVA, L. C., NACHTIGALL, A. M., & BOAS, B. M. V. Vida de prateleira de iogurte sabor café. Coffee Science, v. 11, p. 538 -543, 2016.
6. HATI, S.; PATEL, N.; MANDAL, S. Comparative growth behaviour and biofunctionality of lactic acid bacteria during fermentation of soy milk and bovine milk. Probiotics and antimicrobial proteins, v. 10, n. 2, p. 277-283, 2018.
7. COSTA, B. A. E MACIEL, J. F. Prevalência de Streptococcus Thermophilus em iogurtes comerciais produzidos no Brasil. Trabalhos premiados no XXVII Encontro de Iniciação Científica da UFPB: Editora UFPB, Série Iniciados 2018-2019, v. 25 ISBN: 978-85-237-1569-4, 2020.
8. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa nº 68 de 12 de dezembro de 2006: métodos analíticos oficiais físico-químicos para controle de leite e produtos lácteos, 2006.
9. FAGNANI, R., SCHUCK, J., BOTARO, B. G., & SANTOS, F. C. D. Extended storage of cold raw milk on yogurt manufacturing. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 52, n. 2, p. 104-112, 2017.
10. GALLARDO-RIVERA, C., BÁEZ-GONZÁLEZ, J. G., GARCÍA-ALANÍS, K. G., TORRES-ALVAREZ, C., DARES-SÁNCHEZ, K., SZYMANSKI, A., … & CASTILLO, S. Effect of Three Types of Drying on the Viability of Lactic Acid Bacteria in Foam-Mat Dried Yogurt. Processes, v. 9, n. 12, p. 2123, 2021.
11. WEERATHILAKE, W. A. D. V. et al. The evolution, processing, varieties and health benefits of yogurt. International Journal of Scientific and Research Publications, v. 4, n. 4, p. 1-10, 2014.
12. WANG, X. et al. ATPase‐Defective Variants of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Contribute to Inhibition of Postacidification of Yogurt during Chilled Storage. Journal of food science, v. 78, n. 2, p. M297-M302, 2013.
13. XU, Z; LI, S.; GONG, G.; LIU, Z.; WU, Z.; MA, C. Influence of different acidifying strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus on the quality of yoghurt. Food science and technology research, v. 21, n. 2, p. 263-269, 2015.
14. DERVISOGLU, M. et al. Natamycin content and quality evaluation of yoghurt from smalland large-scale brands in Turkey. Food Additives & Contaminants: Part B, v. 7, n. 4, p. 254-260, 2014.
15. BEZERRA, A. C. DA S.; BEZERRA, J. DE S.; SILVA, M. L.; COSTA, C. M.; DOS SANTOS, R. S.; BRAGA, C. S.; SANTOS, I. L. Determinação de pH e acidez de iogurtes comercializados em três estabelecimentos no município de Coari-AM. Revista Ensino, Saúde e Biotecnologia da Amazônia, v. 1, n. especial, p. 1, 27 jun. 2019.
16. SILVA, F. C. G.; DALAQUA, S.; AZEVEDO, E. C.; CAMPOS, G. M.; RAGHIANTE, F.; MARTINS, O. A. Perfil do ácido lático no prazo de validade de iogurte natural integral. Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, v.10, n.4, p. 595 –603, out -dez 2016.
17. FARIAS, P. K. S.; NOGUEIRA, G. A. B.; DOS SANTOS, S. G. A.; PRATES, R. P., & DE SOUZA, C. N. Contagem de bactérias lácticas em iogurtes comerciais. Caderno de Ciências Agrárias, v. 8, n. 3, p. 38-44, 2016.